Biochimica Applicata (5+1 CFU)

Docente: Simona Viglio

Dipartimento: Medicina Molecolare, Unità di Biochimica

Indirizzo: Viale Taramelli, 3b

E-mail: simona.viglio@unipv.it

Orario di ricevimento: su appuntamento

Obiettivi

Acquisizione delle conoscenze di base riguardanti la struttura e la funzione degli acidi nucleici Acquisizione delle principali metodiche utilizzate per la purificazione e l'analisi delle proteine, e per l'espressione di proteine ricombinanti.

Contenuti

Studio dei costituenti cellulari: metodi di omogeneizzazione di tessuti e di separazione dei costituenti subcellulari. Metodi di estrazione delle proteine da diversi tipi di tessuti. Precipitazione frazionata di proteine: precipitazione frazionata con solfato d'ammonio e isoelettrica; precipitazione con solventi organici; precipitazione al calore. La dialisi: principi e applicazioni.

Spettrofotometria: principi e applicazioni. Legge di Lambert-Beer. Dosaggi colorimetrici.

Tecniche cromatografiche: principi generali, parametri cromatografici e piatti teorici. Cromatografia su colonna. Cromatografia di adsorbimento e ripartizione. Cenni sulla TLC. Cromatografia a scambio ionico. Croamtografia per gel filtrazione. Cromatografia di affinità. Cromatografia ad interazione idrofobica.

Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC): descrizione delle varie componenti di un cromatografo ad alta prestazione. Cromatografia in fase normale (NP-HPLC) e in fase inversa (RP-HPLC). Accoppiamento ionico.

Fast protein liquid cromatography (FPLC): principi e applicazioni.

Tecniche elettroforetiche: principi generali e fattori che influenzano la mobilità elettroforetica. Elettroforesi in fase libera: cenni. Elettroforesi su gel: SDS -PAGE ed elettroforesi su gel di agarosio. Western blotting. Cenni all'isoelettrofocalizzazione e all'elettroforesi bidimensionale. Elettroforesi capillare.

Spettrometria di massa: principi e applicazioni. Ionizzazione ad impatto elettronico (EI), ionizzazione chimica (CI), ionizzazione per electrospray (ESI), ionizzazione MALDI. Analizzatore a quadrupolo e a tempo di volo (TOF).

Produzione di anticorpi monoclonali: tecnica degli ibridomi.

Basi azotate, nucleosidi e nucleotidi. Legame fosfodiestere. Struttura primaria, secondaria e terziaria. Superavvolgimenti e organizzazione del cromosoma procariotico. Il cromosoma eucariotico: ruolo degli istoni nell'organizzazione della cromatina. Cenni di epigenetica. DNA polimerasi procariotiche. Duplicazione del DNA: fasi di inizio, allungamento e terminazione. Sintesi del filamento veloce e del filamento lento: i frammenti di Okazaki. Replicazione del DNA. Struttura, sintesi e maturazione dell'RNA. Il codice genetico. La sintesi proteica: attivazione degli amminoacidi, inizio, allungamento e terminazione. Controllo dell'espressione genica nei procarioti: operone lattosio e operone triptofano.

Metodi di purificazione del DNA. Enzimi di restrizione: caratteristiche e applicazioni nell'analisi del genoma. Elettroforesi e Southern blotting. amplificazione del DNA mediante PCR e RT (Reverse transcriptase)-PCR. Metodo di Sanger per determinare la sequenza del DNA. Tecniche di clonaggio ed espressione di proteine ricombinanti.

Esercitazioni pratiche

Sono previste 16 ore di laboratorio riguardanti le principali tecniche per lo studio delle proteine e del DNA.